文章轉(zhuǎn)載自“安捷倫診斷與基因組學(xué)”公眾號(hào)
組織學(xué)處理從組織樣本獲得開始，一直到 IHC 結(jié)果的分析，大致分為三個(gè)主要階段：分析前、分析中和分析后。分析前因素會(huì)對(duì)靶標(biāo)的準(zhǔn)確檢測(cè)產(chǎn)生明顯甚至不良的影響。本次會(huì)討論 IHC 和/或 ISH 制備切片時(shí)應(yīng)考慮的一些分析前問題，例如冷缺血時(shí)間、登記和文件記錄及肉眼檢查。
圖 1 分析前階段的處理步驟概覽。
分析前階段是組織從其營養(yǎng)來源（血液供應(yīng)）中取出開始，其中組織的固定時(shí)間很關(guān)鍵 (1)。蛋白降解主要是由自溶引起的。自溶是細(xì)胞內(nèi)所含酶進(jìn)行自我消化的過程， 通常自溶會(huì)立即開始作用。這個(gè)過程會(huì)隨溫度升高而加速。固定用來停止降解，同時(shí)盡可能保留組織成分的結(jié)構(gòu)和完整性。然而，固定本身會(huì)引起假象。理想的固定也應(yīng)同時(shí)保持組織中所有表位的結(jié)構(gòu)，但這是無法實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)楣潭ㄒ鸬幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)改變必然會(huì)改變至少一部分的表位。接下來，我們看冷缺血時(shí)間，登記和記錄及肉眼檢查需要的注意事項(xiàng)。
冷缺血時(shí)間
最近，“冷缺血時(shí)間”以及其可能對(duì) IHC 結(jié)果產(chǎn)生的影響受到更多的關(guān)注。冷缺血的時(shí)間是從組織從身體中取出到組織開始。此時(shí)間應(yīng)盡可能短，在已發(fā)布的指南中為 1 小時(shí)或以下 (2, 3)。圖 2.2 和圖 2.3 說明了延遲固定的有害影響，可能包括免疫反應(yīng)性增強(qiáng)、減低或移位。需要注意的是，由于缺血導(dǎo)致的表位降解無法通過抗原修復(fù)技術(shù)來恢復(fù)。
關(guān)于特定抗原或 I 類分子靶標(biāo)的缺血效應(yīng)的研究相對(duì)較少。 盡管如此，圖 2 顯示了三個(gè) I 類靶標(biāo)中染色模式的變化。如果將缺血時(shí)間記錄作為所有標(biāo)本要求文件的一部分后，可能更易于廣泛了解缺血時(shí)間與不同靶標(biāo)之間的相互關(guān)系。
圖 2.2 冷缺血改變了 MDA-MB-453 細(xì)胞（2+ 細(xì)胞系）中 HER2 的染色強(qiáng)度。立即（0 小時(shí)）固定在 10% NBF 中的細(xì)胞團(tuán)中可觀察到大約一半細(xì)胞為弱至中度的膜染色。僅 1 小時(shí)的冷缺血（細(xì)胞團(tuán)在鹽水浸濕的紗布下保持濕潤）形 態(tài)已經(jīng)正在退變，并且膜染色的細(xì)胞數(shù)量似乎有所增加。兩個(gè)小時(shí)后，染色強(qiáng)度增加。4 小時(shí)冷缺血時(shí)間后，大部分膜染色缺失，細(xì)胞保存較差。這說明需 要及時(shí)固定，不同的冷缺血時(shí)間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜過染色或染色不足。使用 IHC 和 HER2 抗體（A0485）和 Autostainer Link 48 平臺(tái)進(jìn)行細(xì)胞染色。
圖 2.3 MDA-MB-453 (Ki-67 & Cyclin D1) 和 MDA-MB-231 (p53) 細(xì)胞團(tuán)立即（0 小時(shí)）在 10% NBF 中固定或在放入 NBF 前保持 1 小時(shí)、2 小時(shí)或 4 小時(shí)（固定前將細(xì)胞團(tuán)在鹽水浸濕的紗布下保持濕潤）。對(duì)于 Ki-67 和 p53，隨著 冷缺血時(shí)間的增加，由于抗原從細(xì)胞核中移位，逐漸觀察到更多的“結(jié)締組 織”染色。對(duì)于 Cyclin D1，觀察到染色逐漸丟失，并出現(xiàn)一些移位。切片使用 Autostainer Link 48 平臺(tái)進(jìn)行染色，采用 FLEX 檢測(cè)和以下的 FLEX RTU 一 抗：MIB-1 (Ki-67)、DO-7 (p53) 和 EP12 (Cyclin D1)。
登記和文件記錄
實(shí)驗(yàn)室接收標(biāo)本后，會(huì)對(duì)其進(jìn)行“登記”并分配唯一的可追溯編號(hào)。每個(gè)手術(shù)標(biāo)本隨附的文件（申請(qǐng)）應(yīng)包括：患者和醫(yī)生信息、采集日期、臨床信息、標(biāo)本部位和類型、采集時(shí)間、冷缺血時(shí)間、固定劑類型和固定時(shí)間(3)。如果需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫鈣，還必須記錄以下信息：脫鈣前固定的時(shí)間、使用的脫鈣類型、脫鈣時(shí)間和任何脫鈣后處理 (4)。登記期間的標(biāo)本驗(yàn)證過 程中應(yīng)確認(rèn)申請(qǐng)中的信息是否與標(biāo)本容器上的信息匹配。標(biāo)本容器應(yīng)至少有兩個(gè)標(biāo)識(shí)信息，例如患者姓名和出生日期。
有充分研究表明，在 10% 中性緩沖福爾馬林溶液中的時(shí)間長度對(duì) IHC 結(jié)果有不同的影響。然而，獲取所有標(biāo)本所需的信息可能存在挑戰(zhàn)。例如，2010 年進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查旨在確定 757 家實(shí)驗(yàn)室是否符合美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)/美國病 理學(xué)家協(xié)會(huì) HER2 檢測(cè)指南要求，其結(jié)果顯示大約 28% 的受訪機(jī)構(gòu)在病例報(bào)告中沒有包含固定處理信息 (5)。報(bào)告固定時(shí)間對(duì)于判定和排除異�；蝾A(yù)期外結(jié)果很有價(jià)值。還可能影響方案選擇，例如所需抗原修復(fù)或酶消化的類 型或時(shí)間以及對(duì)照材料的選擇 (6)。采集團(tuán)隊(duì)（通常是臨床或外科團(tuán)隊(duì)）應(yīng)負(fù)責(zé)提供標(biāo)本信息，包括冷缺血時(shí)長和將標(biāo)本置于固定液中的時(shí)間。病理學(xué)團(tuán)隊(duì)有責(zé)任制定指南，其中應(yīng)明確概述確定標(biāo)本是否可用于 IHC 染色的標(biāo)準(zhǔn)。
肉眼檢查
標(biāo)本認(rèn)定為合格后，即可對(duì)其進(jìn)行大體檢查。此過程稱為肉眼檢查，是一種關(guān)鍵的分析前步驟，并需要適當(dāng)培訓(xùn)。較大的樣品應(yīng)進(jìn)行“面包樣”切片成大約 5 mm 的厚度并放置在 10% NBF 中�？梢栽诒∑g放置紗布或紙巾以便于暴露固定劑。必須注意以標(biāo)準(zhǔn)化方式處理每種類型的組織，避免對(duì)組織造成物理損傷。通常，需要從較大的標(biāo)本中選擇關(guān)注的區(qū)域。這些組織片或塊應(yīng)修剪為長度和寬度不超過 20 mm，或厚度不超過 4 - 5 mm 的尺寸。然后將修剪過的組織放入包埋盒中，并立即浸入所需的固定劑（通常為 10%NBF）中。固定液的體積應(yīng)約為標(biāo)本體積的 10 - 20 倍(3, 7)。福爾馬林溶液會(huì)相對(duì)較快地進(jìn)入組織，但實(shí)際固定組織的化學(xué)過程耗時(shí)更長，至少需要 24 小時(shí)(8)。在計(jì)算固定的總時(shí)間時(shí)，必須包括標(biāo)本在肉眼檢查區(qū)域和自動(dòng)組織脫水機(jī)上置于 10%NBF 中的時(shí)間。
以上內(nèi)容僅限研究使用。不可用于診斷目的。
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